Role of pro-and anti-inflammatory lipids in intracellular survival and killing of mycobacteria

Several immune mediated diseases, such as autoimmunity and allergy or transplant rejection are consequence of inappropriate immune responses towards specific antigens. The therapeutic induction of robust immune tolerance has, therefore been considered the Holy Grail of immunology since the pioneering work of Medawar and colleagues who have demonstrated the feasibility of tolerance induction. Immune tolerance is defined as the unresponsive state to a set of antigens by an immune system that remains immune competent to respond to unrelated antigens. A wealth of mechanisms has evolved to achieve immune tolerance to self as well as many environmental antigens. These mechanisms include negative selection in the thymus together with the production of regulatory T cells dedicated to the prevention of auto reactivity; cytokines like IL-10; immune privileged sites; and peripheral control of effector T cells by apoptosis, anergy, competition, and differentiation of several types of regulatory immune cells. In the last twenty years much emphasis has been given to a powerful regulatory T (Treg) cell population initially characterized by the high expression of CD25 (the alpha chain of the IL-2R), that express the transcription factor Foxp3. Over the years a significant amount of information on Tregs has been acquired which empowered the immunologists to devise new strategies to differentiate and expand these cells and ultimately to use them as cellular therapies. One strategy known to induce immune tolerance takes advantage of biological agents such as monoclonal antibodies (MAbs) that can specifically target certain molecules modulating immune responses. Several studies in different animal models of immune disorders have shown the efficacy of MAbs at inducing long term specific immune tolerance. Non depleting anti-CD4 MAb has been shown able to induce immune tolerance in transplantation and autoimmunity by inducing a specific Treg population. In the work presented in this thesis we have shown that non depleting anti-CD4 can induce robust tolerance to soluble antigens in a mouse model of allergic asthma – a Th2-driven pathology. CD4-blockade at the time of allergen exposure can lead to antigen-specific tolerance therefore sparing the immune response to other antigens. Based on these findings, where the allergen is administered together with an adjuvant, we revisited immune tolerance to therapeutic proteins using a mouse model of hemophilia. It had been reported that tolerance induced with MAbs (such as anti-CD4) was difficult to induce to proteins like factor VIII. We hypothesized that an adjuvant, such as alum, that in the animal models of allergy allows tolerance induction to model antigens and allergens, may be useful to facilitate tolerance to FVIII. We confirmed that indeed tolerance induction to FVIII can be induced when alum is used as an adjuvant – a counter-intuitive finding given the tendency of adjuvants to boost, rather than inhibit, immune responses. We believe that for proper tolerization of antigen-specific cells it is essential to have adequate antigen presentation. Therefore an adjuvant can facilitate the process. This hypothesis will be addressed in future studies. Finally, we investigated the cellular and molecular mechanisms underlying the induction of tolerance to proteins using non-depleting anti- CD4. We anticipated that induction of Foxp3+ T cells would be a major mechanism given prior studies that have clearly established induced Foxp3+ Tregs in tolerance induction in transplantation and autoimmunity. However, we found that tolerance to proteins in alum could be induced in Foxp3-deficient mice, but not in the absence of IL-10. In addition to the dominant tolerance mechanism IL-10-dependent we found evidence for a recessive mechanism based on the activation-cell death and anergy of antigen-specific cells following activation under the cover of anti-CD4. We believe it may be possible to take advantage of both Foxp3- independent and Foxp3-dependent mechanisms to achieve a more robust state of immune tolerance.

Várias doenças causadas pelo sistema imunitário, como doenças autoimunes, alergias ou rejeição de transplantes, são causadas por uma resposta inadequada a alguns antigénios. Uma possível forma de tratar estas doenças consiste na indução de tolerância específica e robusta. A tolerância imunitária é definida como a ausência de resposta por parte do sistema imunitário a um dado antigénio, mantendo-se competente para responder a antigénios distintos. Existem vários mecanismos que asseguram tolerância imunitária a antigénios do próprio e vários antigénios ambientais, tais como a selecção negativa no timo de linfócitos autorreactivos juntamente com o desenvolvimento de células T reguladoras (Treg) que suprimem autorreactividade; locais imunoprivilegiados como a placenta; citoquinas imunorreguladoras como a IL-10; e o controlo na periferia de linfócitos maturos através de apoptose, anergia, competição e diferenciação de diferentes populações celulares reguladoras. Nos últimos vinte anos tem sido dada muita ênfase a uma população de células T reguladoras caracterizada pela elevada expressão de CD25 (a cadeia alfa do receptor de IL-2) e de Foxp3 (um factor de transcrição). Com a aquisição de informação sobre as Tregs, os imunologistas têm tido a capacidade de desenvolver novas estratégias para diferenciar e expandir esta população celular, sendo inclusivamente utilizadas Tregs como terapia celular em ensaios clínicos. Uma forma eficaz de induzir tolerância imunitária em modelos animais consiste na utilização de anticorpos monoclonais (MAbs), dirigidos a moléculas envolvidas na activação de linfócitos. Vários estudos em modelos animais de patologias do sistema imunitário demonstram a eficácia destes MAbs na indução de uma tolerância robusta a longo prazo. O anti-CD4 não depletante, em particular, é bastante eficaz na indução de tolerância imunitária em transplantação e autoimunidade induzindo uma população de Tregs. No trabalho descrito nesta tese demonstrámos que o anti-CD4 não depletante é capaz de induzir tolerância num modelo animal de asma alérgica, que é uma patologia dependente de uma resposta imunitária do tipo Th2. O bloqueio do CD4 concomitante com a exposição ao alergénio leva à indução de um estado de tolerância específica para esse antigénio, mantendo-se a competência do sistema imunitário para responder a outros antigénios diferentes. Com base nestes resultados, onde para a indução de tolerância utilizámos antigénios administrados juntamente com um adjuvante (alum), decidimos estudar a indução de tolerância a outras proteínas. Com efeito, estudos prévios mostraram ser particularmente difícil induzir tolerância a factor VIII (FVIII) em modelos animais de hemofilia, utilizando anti-CD4 ou outros anticorpos indutores de tolerância. Decidimos reavaliar a indução de tolerância a FVIII em hemofilia com base na hipótese que um adjuvante poderia facilitar esse processo. Com efeito verificámos que a administração de FVIII com alum permite a obtenção de tolerância robusta ao factor de coagulação com anti-CD4. Estes resultados poderão parecer contra-intuitivos pois os adjuvantes são conhecidos pela sua capacidade de potenciar respostas imunitárias e não de as inibir. No entanto é provável que para indução terapêutica de tolerância seja necessário que o antigénio a tolerar seja apresentado de forma eficaz à maioria de células T efectoras específicas durante o período 13 em que o anti-CD4 se mantém em níveis terapêuticos. Um adjuvante poderá assim facilitar a apresentação de antigénios pelas células dendríticas durante este período. Esta hipótese será avaliada em experiências futuras. Finalmente, procurámos identificar os mecanismos celulares e moleculares associados à indução de tolerância imunitária a proteínas em adjuvante. Como está descrito na literatura que o anti-CD4 promove, em transplantação e autoimunidade, a diferenciação de Tregs Foxp3+, assumimos que o mesmo mecanismo estaria envolvido na indução de tolerância a proteínas em alum. Contudo, verificámos ser possível indução de tolerância em animais deficientes em Foxp3. No entanto o estado de tolerância depende de IL-10, pois não é possível induzir tolerância em animais na ausência desta citoquina. Para além deste mecanismo de tolerância dominante dependente de IL-10 também está envolvido um componente recessivo, que depende da anergia e apoptose de células efectoras específicas É possível que a combinação de estratégias que promovem mecanismos indutores de tolerância independentes de Foxp3 e outras estratégias que promovam tolerância mediada por Treg possam ser explorados de um modo sinergético para alcançar um estado de tolerância mais robusto e em situações mais estringentes.