IL-4 and TAL1 in T-cell acute lymphoblastic leukemia: studies on the participation of microenvironmental cues and cell-autonomous alterations in leukemogenesis

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most frequent cancer found in children and results from the clonal expansion of transformed lymphoid precursors. Approximately 15% of pediatric ALL patients present with a T-cell phenotype (T-ALL). Despite the recent improvements in the treatment of T-ALL, there are still a high number of relapses and the intensive chemotherapeutic regiments used are associated with long-term severe complications. In order to develop new therapeutic strategies that can further increase efficacy while reducing side effects, one needs to better understand the pathobiology of T-ALL. In particular, it is necessary to understand how microenvironmental and cell-autonomous mechanisms influence the initiation and the progression of leukemia. The present thesis has the preocupation of exploring the mechanisms by which both an extracellular cue (IL-4) and a cell-intrinsic transcription factor (TAL1) may partake in leukemia development and maintenance. Interleukin-4 (IL-4) is a γ-common chain cytokine produced within the bone marrow microenvironment that is known to promote the in vitro proliferation of T-ALL cells. In Chapter 2, we present evidence that IL-4 induces primary T-ALL cell cycle progression from G0/G1 into S and G2/M, by up-regulating cyclin D2, E and A and down-regulating the cyclin-dependent kinase inhibitor p27kip1. Transfection of T-ALL cells with the VP22-p27kip1 fusion protein, which is able to translocate into the cytoplasm and nucleus of target cells, abrogates IL-4-mediated proliferation. This indicates that p27kip1 downregulation is mandatory for cell cycle progression of T-ALL cells stimulated with IL-4. Furthermore, IL-4 stimulates mTOR activation, as determined by increased phosphorylation of its downstream targets p70S6K, S6 and 4E-BP1. Inhibition of mTOR signaling with rapamycin prevents IL-4-induced T-ALL cell growth, cell cycle progression and proliferation. Our results identify mTOR as a critical regulator of IL-4-mediated effects in T-ALL cells and support the rationale for using mTOR pharmacological inhibitors in T-ALL therapy (Cardoso et al. Leukemia 2009). The basic helix-loop-helix transcription factor TAL1 is aberrantly expressed in up to 65% of T-ALL patients. LMO2, a Lim-only domain protein, is often co-expressed ectopically with TAL1 in this malignancy. These genes appear to have leukemogenic potential, since both TAL1 and LMO2 transgenic mice develop leukemias of T-cell phenotype. However, it is still unclear whether TAL1 is effectively leukemogenic in humans, or whether merely participates as a secondary event in the transformation Abstract xiii process in T-ALL. To address this question, we transduced hematopoietic progenitors with TAL1 and/or LMO2 and co-cultured them with OP9-Dll1 stromal cells, which have the capacity to induce T-cell differentiation in vitro. We found that TAL1 and LMO2 genes deregulate human T-cell differentiation in stromal cell co-cultures. Interestingly, the coordinated expression of both TAL1 and LMO2 led to a relative increase in CD3+CD4+CD8+ T-cell precursors with increased cell size. This observation is particularly interesting given that TAL1-expressing patients normally display a similar phenotype. These preliminary results show that TAL1 and LMO2 can disrupt normal human T-cell development, therefore likely predisposing thymocytes to malignant transformation (Chapter 3). In our effort to characterize the mechanisms by which TAL1 might promote T-cell leukemogenesis, we developed a TAL1 inducible system, by fusing TAL1 with the hormone binding domain (HBD) of the estrogen receptor (ER), which we expressed in a TAL1-negative T-cell line. Upon 4-Hydroxi-Tamoxifen (4OHT) treatment, ER-TAL1 fusion protein is able to translocate into the nucleus and consequently trigger its transcriptional program. Gene expression profiling of 4OHT-treated HPB-ALL cells stably transduced with the ER-TAL1 fusion revealed a total of 26 genes up- or down-regulated by TAL1 activation, in at least two independent experiments. We selected seven of those genes on the basis of their function/potential interest in cancer and confirmed the differential expression of three (CASZ1, DMGDH and OR5M3) by qRT-PCR. Accordingly, transfection of another TAL1-negative T-ALL cell line, P12, with TAL1, also led to increased expression of the validated TAL1 target genes. The possible involvement of CASZ1 in TAL1-mediated anti-apoptotic and proliferative effects in T-ALL cells was subsequently investigated. Knock-down of TAL1 with siRNA in the TAL1-positive T-ALL cell line Jurkat decreased the expression of CASZ1, correlating with loss of cell viability. Moreover, CASZ1 knockdown in Jurkat cells led to functional effects similar to those of TAL1 knockdown, namely a decrease in survival and proliferation. Overall, these studies allowed the identification of three novel TAL1 downstream targets, likely with functional relevance for TAL1-mediated leukemogenic potential (Chapter 4). TAL1 binds to repressive chromatin complexes, namely involving HDAC1, and incubation with HDAC inhibitors (HDACis) promotes apoptosis of leukemia cells derived from TAL1 transgenic mice. In Chapter 5, we evaluated the impact of HDACis on TAL1 from a somewhat different perspective, namely by analyzing their impact on Abstract xiv TAL1 expression rather than transcriptional activity. We found that incubation of T-ALL cells with HDACis strikingly down-regulates TAL1 protein expression. This is due to decreased TAL1 gene transcription in cells with an intact TAL1 locus, and to impaired TAL1 mRNA translation in cells that harbor the TAL1d deletion. Importantly, HDACi-induced apoptosis of T-ALL cells is significantly reversed by TAL1 forced over-expression. Our results indicate that the HDACi-mediated apoptotic program in T-ALL cells is partially dependent on the down-regulation of TAL1 expression, and suggest that integration of HDACis into T-ALL treatment protocol may be of potential therapeutic benefit (Cardoso et al, Leukemia 2011, advance online publication). Taken together, the results described in this thesis highlight the importance that microenviromental factors, such as IL-4, might have in the progression of T-ALL (for instance, by activating mTOR and promoting cell cycle progression), and hint on the importance that cell-autonomous factors, such as TAL1 and LMO2, may have in predisposing T-cells for malignant transformation and promoting survival of T-ALL cells. Importantly, our results further demonstrate that both extracellular cues and intracellular molecular lesions can constitute targets for therapeutic intervention in T-ALL.

A Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é o cancro mais frequente em crianças, resultando da expansão clonal maligna de precursores linfóides. Aproximadamente 15% dos doentes com LLA apresentam marcadores de células T (LLA-T). Embora os regimes quimioterápicos actualmente em uso sejam bastante eficazes, existe ainda um número significativo de doentes que recidivam. Além disso, os regimes intensivos de quimioterapia estão normalmente associados a efeitos secundários consideráveis a médio e longo prazo. Para melhor perceber a biologia da LLA-T e determinar novos alvos terapêuticos é necessário perceber em que medida factores microambientais e mecanismos intra-celulares influenciam a génese e a progressão da leucemia. A presente tese procura identificar os mecanismos pelos quais tanto um factor extracelular (IL-4) como um factor de transcrição celular (TAL1) podem participar no desenvolvimento e progressão da leucemia. A Interleucina-4 (IL-4) é uma citocina da cadeia comum-γ, produzida na medula óssea, que estimula a proliferação in vitro de células LLA-T. No capítulo 2, demonstramos que a IL-4 induz a progressão do ciclo celular da fase G0/G1 para as fases S e G2/M em células LLA-T primárias, devido ao aumento da expressão das ciclinas D2, E e A e à diminuição de expressão do inibidor de cinases dependentes de ciclinas p27Kip1. A transfecção de células LLA-T com a proteína de fusão VP22-p27Kip1, que é capaz de translocar para o citoplasma e núcleo das células alvo, impede a proliferação mediada por IL-4. Além disso, a IL-4 estimula a activação de mTOR, como demonstra o aumento de fosforilação dos seus alvos p70S6K, S6 e 4E-BP1. A inibição da sinalização mediada por mTOR com rapamicina impede o crescimento celular, a progressão do ciclo celular e a proliferação de células LLA-T estimuladas por IL-4. Estes resultados identificam mTOR como um regulador dos efeitos moleculares e celulares promovidos por IL-4 em células LLA-T e fortalecem a hipótese do uso de inibidores farmacológicos de mTOR no tratamento de doentes com LLA-T (Capítulo 2; Cardoso et al. Leukemia 2009). O factor de transcrição hélice-volta-hélice TAL1 é aberrantemente expresso em quase 65% dos doentes com LLA-T. A proteína “Lim-only domain” LMO2, é geralmente co-expressa com TAL1 neste tipo de leucemia. Estes genes parecem contribuir para a génese da leucemia, visto que ratinhos transgénicos para TAL1 e LMO2 desenvolvem leucemia com fenótipo de células T. No entanto, não se confirmou Resumo x até hoje se TAL1 estará envolvido na génese da leucemia em seres humanos, ou apenas secundariamente activado como resultado do processo de transformação em LLA-T. Para responder a esta questão, transduzimos progenitores hematopoiéticos com TAL1 e/ou LMO2 e co-cultivamos estes progenitores com células estromais OP9-Dll1, que têm a capacidade de induzir a diferenciação de células T in vitro. Descobrimos que os genes TAL1 e LMO2 desregulam a diferenciação de células T em co-cultura com células estromais. A expressão coordenada destes dois genes leva a um pequeno aumento de precursores T CD3+CD4+CD8+ de tamanho celular aumentado. Esta observação é particularmente interessante visto que se sabe que os blastos de pacientes com LLA-T que expressam TAL1 apresentam um imunofenótipo idêntico. Estes resultados preliminares mostram que TAL1 e LMO2 podem perturbar o normal desenvolvimento de células T humanas, possivelmente predispondo os timócitos para transformação maligna (Capítulo 3). Com o intuito de identificar e caracterizar os eventuais alvos transcricionais através dos quais TAL1 poderá gerar leucemia de células T, desenvolvemos um sistema indutível em que a fusão de TAL1 com o domínio de ligação a hormonas (DLH) do receptor de estrogénio (RE) permite a regulação fina da actividade de TAL1 numa linha celular T sem expressão de TAL1 endógeno. Após tratamento com 4-Hidróxi-Tamoxifeno (4HT), a proteína de fusão RE-TAL1 consegue translocar para o núcleo celular e consequentemente activar o seu programa de trancrição. O perfil de expressão da linha celular HPB-ALL estavelmente transduzida com a fusão RE-TAL1 e tratada com 4HT revelou um total de 26 genes cuja expressão aumentou ou diminuiu após activação de TAL1, em pelo menos 2 experiências independentes. Seleccionámos sete genes com base na sua função e potencial interesse em cancro e confirmámos a expressão diferencial de três (CASZ1, DMGDH e OR5M3) por PCR quantitativo em tempo real. A transfecção de TAL1 numa outra linha celular LLA-T sem expressão deste gene (P12), resulta igualmente num aumento da expressão destes genes. O possível envolvimento de CASZ1 nos efeitos anti-apoptóticos e proliferativos mediados por TAL1 em células LLA-T também foi investigado. A diminuição da expressão de TAL1 com siRNA na linha celular Jurkat, que expressa TAL1 abundantemente, diminui significativamente a expressão de CASZ1, e a perda de expressão correlacionacom perda de viabilidade celular. Acresce que a diminuição da expressão de CASZ1 em células Jurkat tem efeitos funcionais semelhantes aos que ocorrem após redução da expressão de TAL1, nomeadamente diminuição da viabilidade celular e proliferação. Resumo xi No geral, estes estudos permitiram a identificação de três novos genes alvo de TAL1, com possível relevância funcional no contexto do potencial poder oncogénico de TAL1 (Capítulo 4) TAL1 parece ter não apenas um papel de regulador positivo mas também de repressor da transcrição. Não é, portanto, de surpreender que tenha sido demonstrado anteriormente que TAL1 se pode associar a complexos de cromatina repressivos, nomeadamente HDAC1, e que a incubação com inibidores de HDAC (iHDAC) induz apoptose em células leucémicas derivadas de ratinhos transgénicos para TAL1. No capítulo 5, avaliamos o impacto dos iHDAC em TAL1 numa perspectiva diferente, nomeadamente analisando o seu impacto na expressão de TAL1 e não no impacto na actividade transcricional. Os nossos estudos revelam que a incubação de células LLA-T com iHDAC diminui drasticamente a expressão da proteína TAL1. Este efeito é devido à diminuição da transcrição do gene TAL1 em células que mantêm o locus TAL1 intacto, mas também devido à diminui da tradução de mRNAs TAL1 em células que contêm a delecção TAL1d. Igualmente importante é o facto da apoptose induzida pelos iHDAC ser inibida pela sobre-expressão de TAL1. Os nossos resultados indicam que o programa apoptótico promovido pelos iHDAC em LLA-T é parcialmente dependente da diminuição da expressão de TAL1 e sugerem que a integração de iHDAC no protocolo de tratamento de doentes LLA-T pode trazer benefícios terapêuticos (Cardoso et al, Leukemia 2011, advance online publication). O conjunto dos estudos descritos nesta dissertação destacam a importância que os factores micro-ambientais, como IL-4, podem ter na progressão de LLA-T (por exemplo, activando mTOR e promovendo a progressão no ciclo celular) e mostram a importância que factores celulares como TAL1, e também LMO2, podem ter na predisposição de células T para a transformação maligna e na sobrevivência das células LLA-T. Finalmente, os resultados desta tese demonstram que tanto factores extracelulares como lesões intracelulares podem constituir alvos promissores para intervenção terapêutica em LLA-T.