Immune responses in Bathymodiolus azoricus upon Vibrio challenges: approaches to characterize mussel survival strategies and physiological adaptations in deep sea extreme environments

O ambiente marinho profundo representa uma excelente fonte de investigação para desenvolver e melhorar os conhecimentos sobre os animais que habitam em ambientes extremos e sobre as relações quimiossintéticas estabelecidas nesse ecossistema marinho. Dessa premissa surge a necessidade de entender o funcionamento do sistema imunitário em animais do fundo marinho, nomeadamente do mexilhão do mar profundo Bathymodiolus azoricus. O facto de este mexilhão habitar e desenvolver-se em ambientes extremos, como as fontes hidrotermais marinhas de profundidade, torna-o num interessante modelo para caracterizar as suas estratégias de sobrevivência e adaptações fisiológicas nesses ambientes. Nestas fontes hidrotermais, o seu sistema imunitário está constantemente a ser desafiado por compostos estranhos e microrganismos, como as bactérias do meio ambiente circundante. Contudo, as respostas imunitárias no B. azoricus após contacto com Vibrio não estão completamente compreendidas. As bactérias do género Vibrio são frequentemente patogénicos marinhos que causam grande mortalidade em bivalves. Assim, a presente tese pretende compreender as respostas imunitárias dos mexilhões após a exposição a diferentes estirpes de Vibrio, de modo a elucidar as principais vias de sinalização dos genes e proteínas intervenientes na defesa dos mexilhões durante um determinado estímulo bacteriano. Neste sentido, os métodos apresentados nesta tese têm como base a utilização de diferentes técnicas da biologia molecular, com destaque para o PCR quantitativo em tempo real baseado no princípio da reacção em cadeia da polimerase. Esta técnica foi realizada: em brânquia de mexilhões B. azoricus submetidos ao contacto com diferentes suspensões bacterianas de patogénicos marinhos (Capítulos I); no estudo comparativo da expressão de genes e proteínas entre o mexilhão de profundidade B. azoricus e o mexilhão costeiro Mytilus galloprovincialis (Capitulo II) e no estudo sobre a especificidade da resposta imunitária em diferentes tecidos, entre populações de B. azoricus provenientes das fontes hidrotermais Menez Gwen e Lucky Strike, após contacto com a bactéria Vibrio diabolicus (Capitulo III). No capítulo I desta tese, foi realizado um estudo diferencial das respostas imunitárias em mexilhões de profundidade submetidos em contacto com diferentes estirpes bacterianas, nomeadamente Vibrio splendidus, Vibrio alginolyticus, ou Vibrio anguillarum e um pool das estirpes de Vibrio mencionadas anteriormente, assim como Flavobacterium. Este estudo teve como finalidade investigar a capacidade selectiva de resposta do mexilhão B. azoricus. Os resultados da expressão dos genes foram significativos nos mexilhões infectados com diferentes bactérias marinhas após 12 h e 24 h de exposição. Também os resultados demonstraram um padrão na expressão dos genes com decréscimo do nível da expressão das 12 h para 24 h. Entre os animais testados com diferentes bactérias, os animais infectados com Flavobacterium apresentaram níveis da expressão dos genes superiores às 12 h, enquanto os animais infectados com V. splendidus apresentaram genes com uma maior expressão às 24 h. Ao nível proteico utilizando a técnica SDS-PAGE, diferenças entre 12 h e 24 h foram visualizados principalmente nas proteínas com peso molecular entre 18-20 KDa. Análises multivariadas demonstraram agrupamento hierárquico dos animais infectados e a sua expressão de genes estando de acordo com o padrão da expressão dos genes induzidos pelas bactérias testadas. No capítulo II, foi realizado um estudo comparativo das respostas imunes em duas espécies de bivalves provenientes de distintos ecossistemas, o mexilhão das hidrotermais B. azoricus e o mexilhão costeiro M. galloprovincialis. Ambas as espécies de mexilhões foram submetidas em contacto com V. splendidus, V. alginolyticus, V. anguillarum ou pool das bactérias anteriores. Este estudo teve como finalidade avaliar se as vias de sinalização da expressão dos genes é uma característica comum em diferentes espécies de bivalves. A expressão dos genes revelou que estas espécies de bivalves exibem diferenças significativas entre as 12 h e 24 h após desafios bacterianos assim como das bactérias testadas. Os resultados mostraram que V. splendidus bactéria induz elevada expressão dos genes em ambas as espécies de bivalves, enquanto os genes NF-kB e Aggrecan apresentam níveis de expressão diferentes em B. azoricus e M. galloprovincialis. Os resultados da HPLC- ESI-MS/MS identificaram diferentes sequências peptídicas em brânquias nativas de B. azoricus e M. galloprovincialis, sugerindo que animais apresentam diferenças ao nível da síntese proteica no seu meio ambiente. No capítulo III realizou-se um estudo sobre a especificidade da resposta imunitária com uma abordagem ao nível dos tecidos de brânquia, glândula digestiva e manto, em populações de B. azoricus provenientes das fontes hidrotermais Menez Gwen (MG) e Lucky Strike (LS), após estímulo com uma estirpe bacteriana de V. diabolicus. Os resultados demonstraram especificidade significativa ao nível dos tecidos em ambas as populações de B. azoricus. Contudo, mexilhões de MG mostraram níveis de expressão dos genes superiores em brânquia e glândula digestiva do que dos mexilhões de LS. A maioria dos genes no manto apresentou baixa expressão nos mexilhões de MG e elevada expressão nos animais de LS.