Contribution of RBP-Jk and BS69 to gene regulation by EBNA2 and EBNA3

Resumo

O vírus Epstein-Barr (EBV) é um vírus humano da família Herpesviridae. A infecção de linfócitos B com EBV forma linhas celulares linfoblastóides (LCL), os antígenos nucleares EBNA2, EBNA3A e 3C são necessários para a transformação eficiente de linfócitos B. O EBNA2 actua como um activador transcricional de genes virais e celulares, que causam proliferação celular, actuando como uma molécula adaptadora que se liga às proteínas de ligação do DNA. A mais conhecida destas proteínas é a RBP-Jκ, embora se tenha provado que outros sítios de ligação medeiam as funções de EBNA2. A capacidade superior de transformação de células B do EBV de Tipo 1 (T1), em comparação com o EBV de Tipo 2 (T2), deve-se à maior ou mais rápida indução de um pequeno grupo de genes celulares e virais. Os resultados indicam que EBNA2 se liga a locais próximos destes genes por um mecanismo diferente do processo usual, que envolve os factores de transcrição PU.1 e IRF e não depende do mecanismo habitual envolvendo a proteína celular RBP-Jκ. A proteína BS69, um repressor transcricional, interage com EBNA2 através do seu domínio MYND, que reconhece o motif péptido PXLXP presente em EBNA2. EBNA3A e EBNA3C do EBV Tipo 1 também têm o mesmo motif. Os objectivos deste estudo foram: criar um sistema para identificar os locais de ligação (não RBP-Jκ) de EBNA2 utilizando uma linha celular de Linfoma de Burkitt sem o gene RBPJ (células SM224.9), e testar a ligação de fragmentos de EBNA3A e EBNA3C do Tipo 1 a BS69 através de translação In vitro e ensaio pull-down para determinar se existem diferenças na ligação de cada um à proteína BS69. Foi possível comprovar a expressão de EBNA2 nas células DG75 e SM224.9, embora não tenha sido possível determinar quais os genes que EBNA2 pode activar sem utilizar RBP-Jκ. Os resultados são consistentes em todos os ensaios pull-down repetidos, com o EBNA3A e 3C de T1 possuindo uma ligação distinta à proteína BS69. É notável que há uma ligação mais forte de T1 EBNA3C a BS69. T1 EBNA3A é capaz de se ligar melhor a BS69 quando comparado com o T2 EBNA3A e EBNA3C. Em todos os ensaios foi possível observar algumas ligações não específicas a Rab11b, utilizada como controlo negativo. Os ensaios pull-down foram repetidos várias vezes para se obterem melhores condições de ligação, ajustando os tempos de incubação com o produto de IVT e mudando as condições de lavagem, no intuito de tentar reduzir a ligação não específica (tanto para GST-Rab11b como para as esferas). A alteração das condições não reduziu significativamente a ligação inespecífica, quer a Rab11b quer às esferas.

Data do prémio	27 abr. 2017
Idioma original	English
Instituição de premiação	Universidade Católica Portuguesa
Supervisor	Paul Farrell (Supervisor)