Controlled release of tethered peptides from alginate hydrogels via enzymatic linker degradation

Resumo

A medicina regenerativa requer intervenções terapêuticas inovadoras para acomodar elevadas concentrações de morfogénios em depósitos locais e proporcionar a sua distribuição sustentada para uma maior eficácia. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de um hidrogel sensível à ação de MMPs para a libertação localizada do fragmento ativo do péptido promotor do crescimento osteogénico (OGP10-14, YGFGG), para aplicação em terapias de regeneração óssea. Para este efeito, foram desenvolvidas duas sequências peptídicas distintas. Ambas foram sintetizadas utilizando uma estratégia em fase sólida (SPPS), através da extensão da extremidade amina da sequência original YGFGG, com uma sequência sensível a MMPs (PVGLIG) e com uma sequência insensível à ação da enzima (scrambled, GIVGPL). Após a síntese, os péptidos foram acoplados quimicamente ao alginato, um polímero com a capacidade de formar hidrogéis. O estudo baseia-se na hipótese de que, na presença de MMPs específicas (nomeadamente, a MMP-2), a sequência PVLIG pode ser enzimaticamente clivada, ocorrendo a libertação do OGP10-14 a partir do hidrogel de alginato. Por outro lado, o OGP permaneceria acoplado ao hidrogel quando se utiliza a sequência insensível à ação da MMP-2 (scrambled). As sequências peptídicas foram sintetizadas com sucesso por SPPS, e analisadas por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS). Posteriormente foram caracterizadas relativamente à sua sensibilidade à ação das proteases. A extensão da clivagem do péptido, após incubação com a MMP-2, foi determinada utilizando o ensaio de fluorescamina, e as alterações na massa molar dos péptidos foram determinadas por LC-MS. A sequência PVGLIG foi efetivamente hidrolisada pela MMP-2 no local de clivagem previsto (G↓L). O péptido scrambled foi, também, parcialmente hidrolisado, embora não especificamente e com taxas de clivagem mais reduzidas. A cinética de clivagem do péptido foi ainda analisada utilizando sequências FRET desenvolvidas para monitorizar o aumento, ao longo do tempo, de fluorescência resultante da fragmentação do péptido. Os resultados demonstraram que ambos os péptidos foram parcialmente clivados por proteases presentes no soro, no entanto, o péptido PVGLIG revelou-se muito mais sensível à ação da MMP-2 do que o péptido scrambled. Foram também realizados estudos preliminares para avaliar a bioatividade do OGP10-14, através da incubação de células estaminais mesenquimais humanas (hMSC) com as duas sequências peptídicas. A diferenciação osteogénica foi promovida de forma mais eficiente na presença do péptido PVGLIG. Os péptidos foram acoplados ao alginato por química de carbodiimida. A quantidade de péptido imobilizado foi quantificada por UV-Vis e através da quantificação da proteína total com ácido bicinconínico (BCA). Os resultados demonstraram que o procedimento de acoplamento foi bem-sucedido, com eficiências de 41% (PVGLIG) e 62% (scrambled). A clivagem do complexo péptido-alginato pela MMP-2 foi analisada recorrendo ao ensaio da fluorescamina. A hidrólise observada foi mais evidente no caso em que o alginato se encontrava acoplado ao péptido PVGLIG. O estudo forneceu, assim, a “prova de conceito” de que o complexo PVGLIG-alginato foi corretamente desenvolvido, no sentido em que, como esperado, demonstrou ser sensível à clivagem por parte da enzima MMP-2 revelando potencial para ser uma plataforma útil para a libertação in situ de OGP.

Data de atribuição	2012
Idioma original	English
Instituição de premiação	Universidade Católica Portuguesa
Supervisor	Cristina Carvalho Barrias (Supervisor)