Detection of fluoroquinolone resistance and efflux pumps activity by flow cytometry

Resumo

As fluoroquinolonas são fármacos bactericidas amplamente utilizadas devido à sua elevada actividade e largo espectro nomeadamente contra bactérias gram negativo como é o caso das Enterobactereaceae. A resistência a antibacterianos é um tema preocupante a nível mundial. Os métodos de susceptibilidade clássicos baseiam-se no crescimento bacteriano na presença de antibacterianos, cujos resultados demoram pelo menos 24 a 48 horas a obter, sendo muitas vezes necessário recorrer a terapia empírica. Foi criado um teste rápido para determinar a susceptibilidade de bactérias gram negativo à ciprofloxacina e levofloxacina; no caso de fenótipos resistentes foi desenvolvido um outro protocolo para detectar a presença de sobre-expressão de bombas de efluxo, um mecanismo de defesa bacteriano bem documentado. Tratam-se de testes rápidos e precisos que utilizam a citometria de fluxo e demonstraram grandes vantagens para a Microbiologia clínica. Sessenta e dois isolados clínicos de Enterobactereaceae foram testados para a ciprofloxacina e cinquenta e três para a levofloxacina, previamente avaliados pelo sistema Vitek2®. E. coli K12 geneticamente modificadas com o sistema de efluxo AcrAB-TolC inactivado, sobre-expresso e wild-type foram utilizadas como controlos de efluxo. Para o perfil de susceptibilidade, as células foram incubadas com os breakpoints fornecidos pelo CLSI, em seguida fixadas com etanol 70% (v/v) e marcadas com SYBR-Green I, uma sonda de ácidos nucleicos. A contagem de UFC foi realizada antes da análise citométrica. Para o estudo do efluxo, trinta isolados foram estudados onde as células são diluídas em PBS suplementado com glucose e concentrações subinibitórias de ciprofloxacina e marcadas com brometo de etídio. Em paralelo, as mesmas estirpes são incubadas com clorpromazina, um inibidor de efluxo, e o protocolo repetido. A análise citométrica foi realizada em FL1 (520 nm) e FL3 (600 nm) para a avaliação de susceptibilidade e a determinação do efluxo, respectivamente. As estirpes susceptíveis incubadas com os antibacterianos demonstraram uma diminuição da intensidade de fluorescência comparando com as não tratadas. As estirpes resistentes mantiveram valores aproximados, mesmo após incubação com altas concentrações de fármaco. Verificou-se correlação entre a contagem de UFC e a citometria de fluxo. Para o ensaio de efluxo, comparou-se a intensidade de fluorescência com e sem clorpromazina. Nos casos de sobreexpressão da bomba de efluxo AcrAB-TolC a intensidade de fluorescência diminuiu. A citometria de fluxo demonstrou ser uma excelente ferramenta para avaliar a resistência às fluoroquinolonas e a responsabilidade do efluxo nessa mesma

Data de atribuição	19 mar. 2014
Idioma original	English
Instituição de premiação	Universidade Católica Portuguesa
Supervisor	Cidália Pina Vaz (Supervisor)