Detergent-free supercritical carbon dioxide

: assisted protocol for the production of sustainable and highly preserved decellularized porcine meniscus for orthopedic applications

Resumo

O desenvolvimento de scaffolds biologicamente funcionais para aplicações meniscais, utilizando a matriz extracelular (ECM) como fonte, tem-se revelado uma alternativa promissora às estratégias de engenharia tecidular. Assim, torna-se necessário desenvolver estratégias de descelularização eficientes que consigam eliminar de forma eficaz os materiais celulares e genéticos, minimizando as respostas imunogénicas e, ao mesmo tempo, preservar ao máximo a ECM, de modo a apoiar as atividades celulares subsequentes essenciais para a regeneração tecidular. Os métodos convencionais de descelularização baseiam-se geralmente na utilização de agentes químicos agressivos, associados à degradação da ECM, à presença de resíduos citotóxicos e a tempos de processamento prolongados, comprometendo a integridade e biocompatibilidade do tecido. Estas limitações têm impulsionado a exploração do dióxido de carbono supercrítico (scCO₂)4uma tecnologia verde e minimamente invasiva4como agente alternativo de descelularização, visando o desenvolvimento de abordagens mais rápidas, económicas e sustentáveis do ponto de vista ambiental. Neste estudo, foi avaliada uma série de protocolos de descelularização assistidos por scCO₂, nos quais foram testados parâmetros operacionais, incluindo o número de ciclos, a velocidade de despressurização, as pressões aplicadas, o tempo de exposição, a utilização de co-solventes, bem como estratégias de lavagem com diferentes solventes, modos de lavagem e intervenções físicas. A eficiência de descelularização foi avaliada através da quantificação de DNA de dupla hélice (dsDNA) residual. A preservação da ECM foi analisada por meio de ensaios bioquímicos para quantificação de glicosaminoglicanos (GAGs), colagénio solúvel e colagénio insolúvel, em paralelo com espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier com reflectância total atenuada (FTIR-ATR) e respetiva análise quimiométrica. Estas avaliações foram também realizadas após esterilização com scCO₂ e o aditivo NovaKillTM, uma mistura composta por ácido peracético (PAA) e peróxido de hidrogénio (H₂O₂). O protocolo assistido por scCO₂4 envolvendo nove ciclos a 160 bar e integrando ciclos de congelação-descongelação, sonicação direta com processador ultrassónico e liofilização4demonstrou a maior eficiência de descelularização, com um conteúdo residual de dsDNA de 88,74 ± 10,25 ng/mg de amostra seca. Adicionalmente, os resultados dos ensaios bioquímicos demonstraram uma preservação significativa da ECM, com apenas degradações mínimas sugeridas pela análise espectroscópica. Após esterilização, não foram observadas diferenças significativas nos resultados da quantificação da ECM nem na análise espectral por FTIR, indicando uma preservação ótima da matriz. Estes resultados destacam o potencial da geração de ECM descelularizada (dECM) através de abordagens assistidas por scCO₂ como uma estratégia promissora para aplicações avançadas em regeneração meniscal.

Data de atribuição	4 set. 2025
Idioma original	English
Instituição de premiação	Universidade Católica Portuguesa
Supervisor	João Bebiano Costa (Supervisor) & Ana Leite Oliveira (Co-Orientador)