Development of a bioluminescent reporter system to monitor neonatal Group B Streptococcal infection

Resumo

A bactéria estreptococos do grupo B (EGB), comensal dos tratos intestinal e geniturinário de adultos saudáveis, é a principal causa de infeções bacterianas em recém-nascidos, incluindo a meningite. A morbidade associada é elevada e até 50 % das crianças que sobrevivem à infeção apresentam sequelas neurológicas permanentes. Para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e neuro protetoras é fundamental uma maior compreensão sobre a fisiopatologia da doença. No entanto, os métodos clássicos de quantificação da infeção não permitem estudos longitudinais, pois implicam a morte do animal. Assim, o objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de um novo sistema bioluminescente com base na luxABCDE que permita monitorizar a disseminação da EGB, através do uso de imagens in vivo em murganhos.Para isso, a estirpe hipervirulenta da EGB (BM110) foi transformada com o plasmídeo pSL101P32, que contém o operão luxABCDE (EGB BM110+pSL101P32). Estudos in vitro mostraram que o sinal de bioluminescência e densidade ótica foram proporcionais ao número de bactérias. Além disso, a presença do plasmídeo não afetou o metabolismo da EGB, uma vez que a sua taxa de crescimento não foi alterada e o plasmídeo permaneceu estável na ausência de pressão seletiva durante 8 dias. A virulência da EGB BM110+pSL101P32 no contexto da colonização do hospedeiro foi avaliada através da capacidade de adesão e invasão às linhas celulares raw 264.7 e Caco-2. Nenhuma diferença significativa foi detetada em relação à estirpe selvagem. De forma a avaliar a virulência in vivo, murganhos recém-nascidos foram inoculados intraperitonealmente com uma dose letal da estirpe selvagem ou bioluminescente. Não foram observadas diferenças na taxa de sobrevivência nem na carga bacteriana presente no cérebro, fígado, pulmões e intestino entre os grupos. No entanto, a bioluminescência só foi detetada em crias infetadas com um inóculo inferior e apenas na região abdominal (local da infeção), o que sugere que este sistema tem uma limitada capacidade de deteção. Assim, foi gerada outra estirpe luminescente, usando um novo plasmídeo que contém a luciferase do pirilampo “red-shifted” [FFluc(PTA)], uma vez que este apresenta uma maior capacidade de penetração dos tecidos. Resultados preliminares revelaram que a emissão de luz pode ser expressa em função do crescimento celular e a bioluminescência obtida foi maior do que com a luxABCDE. Estes resultados sugerem que o FFluc(PTA) é um sistema promissor para monitorizar a disseminação da EGB em recém-nascidos através de técnicas de imagem in vivo, permitindo o estudo de meningite neonatal comprovada.

Data de atribuição	24 fev. 2021
Idioma original	English
Instituição de premiação	Universidade Católica Portuguesa
Supervisor	Elva Bonifácio Andrade (Supervisor) & Paula Ferreira da Silva (Co-Orientador)