Development of a new functional dairy product enriched in microbial bioactive conjugated fatty acids through an industrial-based approach

Resumo

A procura por produtos alimentares inovadores com propriedades de valor acrescentado tem sido uma tendência crescente nos últimos anos. Desta forma, diferentes compostos alimentares com potenciais propriedades bioativas têm sido identificados, como por exemplo o ácido linoleico conjugado (CLA) e o ácido linolénico conjugado (CLNA), os quais têm sido descritos com atividades anti-carcinogénica, anti-obesidade e anti-inflamatória, entre outras. Estes compostos encontram-se naturalmente na carne e no leite de ruminantes ou em óleos vegetais, mas, devido a questões de disponibilidade e concentração, não é exequível obter efeitos benéficos de CLA/CLNA através destas fontes. Alternativamente, tem sido estudado o enriquecimento microbiano in situ de matrizes alimentares, uma vez que foram descritas várias estirpes probióticas com capacidade de isomerizar o ácido linoleico (LA) e o ácido α-linolénico (α-LNA) ao correspondente ácido conjugado. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar o desenvolvimento de um novo produto lácteo de valor acrescentado através da produção microbiana in situ de CLA e CLNA utilizando óleos vegetais comerciais previamente hidrolisados como fontes de substrato, assim como avaliar possíveis metabolitos de ácidos gordos libertados durante o processo, estudar as propriedades bioquímicas e organoléticas, e avaliar a estabilidade em prateleira do produto lácteo desenvolvido. Em primeiro lugar, selecionaram-se estirpes produtoras de CLA/CLNA de entre 85 estirpes probióticas através da deteção molecular de genes que codificam enzimas envolvidas na formação de CLA/CLNA, nomeadamente, linoleato isomerase (LAI), antigénio reativo cruzado da miosina (MCRA) e hidratase de ácido gordos (FA-HY). Para tal, usaram-se primers descritos na literatura e primers desenhados com base em regiões conservadas. Entretanto, determinou-se a tolerância máxima das estirpes ao LA após exposição a 1, 2 e 5 mg/mL. Cerca de 34 estirpes revelaram a presença de pelo menos um dos genes analisados, sendo os primers desenhados neste estudo mais eficientes. Contudo não foi encontrada qualquer associação entre a sua tolerância ao LA e o potencial de produção de CLA. Além disso, apenas 4 estirpes genotipicamente positivas revelaram a capacidade de converter 0,5 mg/mL de LA em isómeros de CLA. Estas foram ainda testadas para a produção de CLNA a partir de 0,5 mg/mL de α-LNA. A estirpe Bifidobacterium breve DSM 20091 demonstrou os melhores valores de produção de isómeros de CLA e CLNA (>50% de conversão do substrato), sendo selecionada para os ensaios seguintes. De seguida, foi estudada a utilização de óleos vegetais comerciais como fontes de substrato para o desenvolvimento de um leite fermentado enriquecido em CLA/CLNA. Para aumentar a biodisponibilidade de LA e α-LNA nos óleos selecionados, isto é, óleo de soja (43,7 g LA/100 g de óleo) e de linhaça (41,3 g α-LNA/100 g de óleo), foram testadas diferentes lípases. A lípase de Candida rugosa apresentou os melhores rendimentos para qualquer um dos óleos testados (>90% de hidrólise). A B. breve DSM 20091 foi depois testada em leite contendo 0,5 mg/mL de LA e/ou α LNA com os óleos hidrolisados. Os resultados mostraram que esta estirpe não foi capaz de produzir CLA simultaneamente com CLNA na mesma extensão. Por conseguinte, foram testadas concentrações de substrato mais elevadas (α-LNA) apenas com óleo de linhaça hidrolisado. Os melhores rendimentos foram obtidos a 2 mg/mL de α-LNA, tendo-se registado cerca de 1 mg/g de isómeros de CLNA maioritariamente. Para avaliar possíveis metabolitos de ácidos gordos, foi efetuada uma análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS) ao leite fermentado com LA puro e/ou α-LNA puro ou óleo de linhaça hidrolisado. Não foram encontrados outros compostos de ácidos gordos que pudessem resultar da metabolização do LA ou α-LNA; no entanto, foram descobertos dois isómeros adicionais de CLNA nunca descritos para as Bifidobactérias. As propriedades bioquímicas e organoléticas do leite fermentado enriquecido com CLNA foram depois avaliadas através da análise do teor de açúcares e ácidos orgânicos, acidez titulável, pH, composição nutricional, perfil de compostos voláteis e propriedades sensoriais. O produto desenvolvido apresentou características comparáveis a outros produtos semelhantes, no entanto, faltaram-lhe propriedades organoléticas importantes, prevalecendo o amargor e a adstringência. Finalmente, foi avaliada a estabilidade do leite fermentado enriquecido com CLNA durante 28 dias de armazenamento refrigerado (4 ºC). Para obter uma via alternativa de administração dos isómeros de CLNA, o leite fermentado enriquecido foi depois liofilizado, sendo também avaliada a sua estabilidade durante o armazenamento (12 semanas à temperatura ambiente). Em ambos os produtos observou-se ao longo do tempo uma perda de ácidos gordos saturados livres e um aumento da quantidade de isómeros conjugados. Em conclusão, a identificação de estirpes potencialmente produtoras de CLA/CLNA não pode basear-se apenas em técnicas de seleção genotípica e/ou de tolerância ao substrato. Apesar disso, foi possível desenvolver um leite fermentado enriquecido em ácidos gordos conjugados com a B. breve DSM 20091 utilizando óleo de linhaça hidrolisado, e esta estirpe mostrou uma preferência para produzir isómeros de CLNA. Além disso, foram descobertos dois isómeros adicionais de CLNA nunca descritos. As características bioquímicas e nutricionais do leite fermentado enriquecido com CLNA foram aceitáveis, mas há propriedades organoléticas a serem melhoradas. Embora os isómeros conjugados nos produtos lácteos desenvolvidos tenham aumentado durante o armazenamento, as alterações nos ácidos gordos saturados livres sugeriram a ocorrência de processos de oxidação.

Data de atribuição	5 jul. 2024
Idioma original	English
Instituição de premiação	Universidade Católica Portuguesa
Supervisor	Ana Maria Gomes (Supervisor), Luís Miguel Rodríguez Alcalá (Co-Orientador) & Maria do Rosário Gonçalves dos Reis Marques Domingues (Co-Orientador)