A resistência a antibióticos representa uma séria ameaça para a saúde humana e um contaminante ambiental relevante. As bactérias resistentes a antibióticos (ARB) e os genes de resistência a antibióticos (ARGs) foram descritos em diferentes contextos, principalmente em casos clínicos, mas também em estações de tratamento de águas residuais ou solos agrícolas. No ambiente, o contexto geral da poluição pode favorecer a persistência ou a proliferação de ARB devido a múltiplas características genéticas. A monitorização de ARGs e de ARB no ambiente pode ter um papel importante na identificação de fontes e vias de disseminação. Para abordar estas questões, esta tese explorou três temas baseados em Pseudomonas aeruginosa resistente a antibióticos e em solo: i) as limitações que podem existir devido aos elevados limites de quantificação de ARGs no solo; ii) a sobrevivência de uma estirpe bacteriana exógena ubíqua (blaVIM+ P. aeruginosa) no solo e os possíveis efeitos de sais de metais; e iii) a relação que poderá existir entre a filogenia e o genoma acessório em diferentes genótipos de resistência a carbapenemos (blaVIM+ ou blaNDM+ P. aeruginosa). O primeiro trabalho (capítulo 3) visou avaliar o limite de quantificação (LOQ) de ARGs (vanA, qnrS, blaTEM, blaOXA, blaIMP, blaVIM) em solo, baseado na hipótese de que doses baixas de ARB e ARGs no solo não são quantificáveis com as atuais técnicas de qPCR, principalmente devido aos procedimentos de extração de DNA. Para determinar o LOQ, microcosmos (10 g de solo agrícola, substrato, areia, solo pousio e composto) foram inoculados com ARB isoladas de águas residuais em doses que variam de 102 a 107 CFU/g de solo seco. As ARB usadas como inóculo continham respetivamente o gene de resistência a vancomicina vanA (E. faecalis), o gene de resistência a quinolonas qnrS (Escherichia coli), e os genes de resistência a β-lactâmicos blaTEM (E. coli), blaOXA (E. coli, Acinetobacter johnsonii), blaIMP (A. johnsonii), blaVIM (P. aeruginosa) com base nos quail os LOQs foram determinados. Os microcosmos foram amostrados para enumerar unidades de formação de colónias bacterianas (CFU), e extrair DNA para quantificação de ARGs por qPCR. O LOQ foi determinado como sendo de 104 cópias de ARG por g de solo seco, independentemente do tipo de solo. Abaixo deste limite, não foi possível quantificar os ARGs mesmo quando o respetivo hospedeiro ARB foi detetado por cultivo. Os resultados apoiam a hipótese de que os valores de LOQ são relativamente elevados e podem sugerir a ausência de ARGs em situações em que estes possam representar um perigo. O segundo trabalho (capítulo 4) visou avaliar o impacto de metais na sobrevivência de um isolado de P. aeruginosa proveniente de efluente hospitalar blaVIM+ e na diversidade da comunidade microbiana do solo. Microcosmos foram preparados com solo agrícola ou neste suplementado com sulfato ou nitrato de cobre e zinco envelhecidos durante um mês, e inoculados com doses conhecidas de P. aeruginosa blaVIM+. A sobrevivência da ARB foi monitorizada com base na enumeração das CFU e quantificação de genes selecionados - extracytoplasmic function sigma factor, ecf, Verona Integron–encoded Metallo-β-Lactamase, blaVIM, class 1 integron-integrase gene, intl1, ao longo de 30 dias. Além disso, foi analisada a composição da comunidade microbiana (sequenciação de amplicão V3-V4 do gene 16S rRNA). Durante este período, a abundância de P. aeruginosa (CFUs/g solo seco) e ecf e blaVIM-2 (número de cópia/g de solo seco) diminuiu em todas as condições testadas, mas foi ainda assim quantificável após 30 dias. Estes resultados confirmam a persistência da ARB no solo ao longo dos 30 dias, excluindo a hipótese de perda do ARG durante este período. A análise do microbioma revelou uma clara influência dos metais na diversidade da comunidade bacteriana, independentemente do tipo de metal ou sal. Este estudo permitiu concluir que a suplementação com metais afeta a qualidade microbiana do solo, mas tem um impacto negligenciável na sobrevivência das bactérias exógenas. Estes resultados destacam a importância de considerar a interação e características microbianas, como a tolerância a metais, na avaliação da persistência da ARB no ambiente. No capítulo 5 foram comparados os genomas de estirpes de P. aeruginosa blaVIM-2+ ou blaNDM-1+. O ARG blaVIM-2 é observado principalmente em espécies de Pseudomonas, enquanto blaNDM-1 é distribuído entre géneros e ordens distintos. O trabalho centrou-se na distribuição filogenética e características genómicas de um conjunto de 116 genomas blaVIM-2+ e 27 genomas blaNDM-1+, de 38 países. Os genomas selecionados foram anotados e as sequências do core genome multilocus sequence type (MLST) foram determinadas. Os genomas blaVIM-2+ e blaNDM-1+ foram analisados usando uma abordagem comparativa do genoma para avaliar os genes do genoma core e acessório, mais tarde usados para determinar a resistência a antibióticos e o perfil funcional das bactérias. Para descrever o ambiente genómico de blaVIM-2 e blaNDM-1, as regiões onde se integravam foram anotadas através da comparação de sequências. As análises da distribuição filogenética e geográfica sugeriram uma distribuição mundial das estirpes pertencentes aos vários STs com casos de endemismo. Os genomas acessórios de blaVIM-2+ e blaNDM-1+ apresentaram diferentes perfis de resistência a antibióticos e funcionais, independentemente da maioria dos ARGs e das famílias de proteínas terem sido partilhados. Curiosamente, a presença simultânea de blaVIM-2 e blaNDM-1 e outros genes de resistência a carbapenemos foi observada em diferentes genomas. Os ambientes genómicos dos dois ARGs eram distintos, sendo blaVIM-2 associado a diferentes transposões (Tn21, Tn402-like na sua maioria) e blaNDM-1 a diferentes sequências de inserção (ISAba125 e bleMBL e IS91). Este trabalho enfatizou a importância de considerar diferentes abordagens para combater a propagação de bactérias resistentes a carbapenemos que avalim a filogenia, e a distribuição geográfica, mas principalmente as características genómicas das estirpes. Os nossos trabalhos visavam indicar possíveis limitações a serem melhoradas na monitorização da resistência aos antibióticos e destacar o papel da filogenia das ARB e das características genéticas que favorecem a propagação dos ARGs. Em particular, o trabalho experimental evidencia a possível sobrevivência de ARB no solo, principalmente em condições de elevada poluição. Além disso, a sobrevivência e a presença destas ARB no solo pode não ser possível de quantificar por métodos de biologia molecular devido ao seu elevado LOQ. O estudo das características genómicas das ARB pode ser útil para prevenir a adaptação aos ambientes e para encontrar mais biomarcadores para a sua monitorização.
| Data do prémio | 10 fev. 2023 |
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| Idioma original | English |
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| Instituição de premiação | - Universidade Católica Portuguesa
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| Supervisor | Célia Manaia (Supervisor), Olga Cristina Pastor Nunes (Co-Orientador) & Ivone Vaz-Moreira (Co-Orientador) |
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